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胰酶消化法培養(yǎng)原代細胞實驗_干細胞搜網(wǎng)_www.stemcell.so

更新時間:2014-05-13

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胰酶消化法培養(yǎng)原代細胞實驗原文鏈接:http://www.stemcell.so/article-837.html

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實驗方法原理 

將動物機體的各種組織從機體中取出,經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用 EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養(yǎng)。因此,較為嚴格地說是指成功傳代之前 的培養(yǎng),此時的細胞保持原有細胞的基本性質,如果是正常細胞,仍然保留二倍體數(shù)。但實際上,通常把*代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。zui常 用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。
 

實驗材料 

胎鼠新生鼠


試劑、試劑盒 

1640培養(yǎng)基牛血清胰酶Hank’s液碘酒


儀器、耗材 

培養(yǎng)箱 培養(yǎng)瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 紗布 手術器械 血球計數(shù)板 離心機 水浴箱


實驗步驟 
一、實驗材料準備

1.  Hank’s液配方:KH2PO4 0.06 g,Nacl 8.0 g,NaHCO3 0.35 g,KCl 0.4 g,葡萄糖1.0 g,Na2HPO4·H2O 0.06 g,加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。

二、具體操作

1.  將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死,置75%酒精泡2-3秒鐘(時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi))再用碘酒消毒腹部,取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)(或將新生小鼠在超凈臺內(nèi))解剖取肝臟,置平皿中。
 
2.  用Hank’s液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
 
3.  用手術剪將肝臟剪成小塊(1 mm2),再用Hank’s液洗三次,轉移至小青霉素瓶中。
 
4.  視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。
 
5.  加入3-5 ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。
 
6.  靜置5-10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
 
7.  1 000 rpm,離心10分鐘,棄上清液。
 
8.  加入Hank’s液5 ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
 
9.  加入培養(yǎng)液1-2 ml(視細胞量),血球計數(shù)板計數(shù)。
 
10.  將細胞調(diào)整到5×105/ml左右,轉移至25 ml細胞培養(yǎng)瓶中,37℃下培養(yǎng)。

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